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Study of factors influencing the dynamics of digestive colonization by Clostridoides difficile and the adaptative immune response. Etude des facteurs influençant la dynamique de colonisation digestive par Clostridoides difficile et de la réponse immune adaptative
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Edité par CCSD -
Context This project is part of a new thematic axis (antibiotics, dysbiosis and infectious risk) in the Pathogenic Bacteria and Health (BaPS) team, which emerged following the fusion on January 1, 2020 with Micalis Institute, UMR 1319 Paris-Saclay University, INRAe, AgroParisTech. Some members of this axis are also affiliated to the clinical microbiology department of GH Paris Saint-Joseph, which hosts the technological platform for drug dosage. Clostridioides difficile is an anaerobe, spore forming bacteria. It is a major enteropathogen causing diarrhea and post-antibiotic colitis. C. difficile infections (CDI) particularly affect patients hospitalized in healthcare settings, which combine high densities of C. difficile spores and high selection pressure by antibiotics. The clinical spectrum of CDI is variable, ranging from asymptomatic colonization to severe clinical presentations that may lead to complications (1,2). Pathophysiology of CDI conventionally included the colonization of gut microbiota disrupted by antibiotic therapy inducing a rupture of the barrier effect (3,4). This colonization step is an essential prerequisite for main clinical signs of infection due to the production of enterotoxins A and B having a cytopathic and pro-inflammatory action on the digestive epithelium. The host immune response plays a central role in the development of CDI by producing antibodies that neutralize the action of these toxins (5,6). CDIs are also characterized by a high rate of recurrences (~ 20%) which have a very significant impact both for healthcare establishments (7,8) and on the quality of life of patients (9). The persistence of C. difficile spores in the gut microbiota, a suboptimal immune response, and the persistence of digestive dysbiosis appear to be important and not exclusive factors for these recurrences (3,5-6). In the end, all of the knowledge on the pathophysiology of CDI made it possible to elaborate new strategies for the prevention and treatment of CDI such as the preservation and restoration of the gut microbiota and therefore of its barrier effect (transplantation of faecal microbiota or new generation of probiotics) and neutralizing the action of toxins either by passive immunization with monoclonal antibodies (bezlotozumab) or after vaccination (4,10). However, there are still many questions for which we have no answers to date. Objectives This project aims to assess the respective impact of different antibiotics of clinical interest (including those used in the treatment of CDI) on the digestive microbiota - by characterizing the dysbiosis induced in correlation with the residual concentrations of antibiotic in the stool; - by evaluating the impact of the dysbiosis induced on the dynamics of colonization by C. difficile until the clearance of the bacteria; - identify the species / groups of bacterial species from the gut microbiota promoting / protecting colonization and / or infection by C. difficile and those promoting the clearance / persistence of colonization by C. difficile; - by evaluating the impact of dysbiosis induced on the host notably i) on the modification of the bile salt profiles, and ii) on the modulation of the host adaptive immune response. Experimental design, material and methods Description of the steps of this project I- The first part of the project will focus on the use of the experimental model of C. difficile infection / colonization in mice, developed by our team. We will continue the work initiated by characterizing the different degrees of dysbiosis caused by several antibiotic regimens and correlated them to residual concentrations of antibiotics in the stools. The respective impact of this dysbiosis will be evaluated on the dynamics of digestive colonization by C. difficile until its clearance and on the host: i) metabolic impact with the modification of the of bile salt profiles whose plays an important role in the germination of C. difficile spores (11) and ii) host immune response. II- The second part of the thesis project will aim to identify, by modeling on the basis of culturomics and metagenomics data, the species or groups of bacterial species of the gut microbiota associated with i) the prevention of the gut colonization by C. difficile, ii) the implantation of C. difficile in the digestive microbiota , and iii) the clearance of spores and vegetative forms of C. difficile. Materials and methods - Experimental model of C. difficile infection / colonization in a mouse model (C57 / Bl6) (12); conditional groups according to different classes of antibiotics of clinical interest, including those conventionally used in the treatment of CDI (vancomycin, metronidazole, fidaxomycin); - Culturomics: quantitative study (CFU / g of stool) of the dynamics of gut colonization by C. difficile (spores and vegetative forms) until the clearance of the bacteria (13,14); - Cultivable and non-cultivable microbiota by targeted metagenomics (based on the amplification then sequencing of ubiquitous 16S rDNA) (14); - Quantitative ELISA technique for serum IgM and IgG and mucosal IgA specifically directed against several factors of interest of the bacteria (toxins and surface components, materials and techniques already available at laboratory) and study of the neutralizing activity of immunoglobulins; - Methods for dosage of residual antibiotics in the stool and qualitative and quantitative determination of the bile salt profiles by UHPLC-ESI-HRAM (Exactive plus, Orbitrap, platform of Drug dosages, GH Paris Saint-Joseph). The project will be carried out within the Bacteria Pathogens and Health (BaPS) team, group 'antibiotics, dysbiosis and infectious risk'. The animal experiments will take place in the Axenic animal facility located on the team's premises (BaPS) on the campus of the University Paris-Saclay, in Châtenay-Malabry (Animex platform). Collaborations All the useful collaborations will be considered during the progress of this project according to the first results obtained. To date, several collaborations are already in progress wfor this project: - team of the GH Paris Saint-Joseph technological platform for drug dosage its expertise (residual antibiotics and bile salt profile and quantification); - the analysis of the gut microbiota by quantitative metagenomics in collaboration with several INRAe teams (collaborations already in progress); - INSERM U1181, Epidemiology and modeling of antimicrobial resistance, Institut Pasteur, directed by Pr D. Guillemot for the identification by modeling of the species / groups of bacterial species of interest within the gut microbiota. Expected results and further studies The first assays showed that we could reproduce an immune response against toxins A and B just like this observed in humans and characterize its kinetics (12). Preliminary assays have shown that the adaptive immune response produced following an ICD was significantly greater among animals treated with ATB than for those which had not been treated. This project will first confirm and consolidate these preliminary results and explore the various hypotheses evocated to explain the determinants behind this result and in particular the impact of dysbiosis induced by co-administered antibiotics. The biological samples collected during thiese assays will be used to characterize more precisely the immune response observed. The second part of this work will identify, by modeling the data collected in vivo, bacterial species of interest promoting colonization by C. difficile or, on the contrary, acting as part of the barrier effect of the microbiota. In parallel with this project, the team will work on the clinically documented biological collections of a prospective cohort of patients infected with C. difficile and followed at Saint-Joseph hospital. By comparing the data collected in parallel with the experimental infection / colonization model in mice with those from patients infected with C. difficile, it will be possible to identify specific species / groups of species in humans. Subsequently, the study of the bacterial species of interest identified during this project will allow a better understanding of the intimate mechanisms leading to colonization. Futher studies will include the study of bacteria-bacteria and bacteria-cell interactions in vitro but also in vivo by their reintroduction into the digestive microbiota of mice with conventional flora or more in an experimental model of infection / colonization in gnotoxenic mice with flora humanized (collaboration with INRAe teams). . Contexte Ce projet s'inscrit dans le cadre de la création d'un nouvel axe thématique (antibiotiques, dysbiose et risque infectieux) dans l'équipe Bactéries Pathogènes et Santé (BaPS), qui a émergé suite à sa fusion au 1er janvier 2020 avec l'institut Micalis, UMR 1319 Université Paris-Saclay, INRAe, AgroParisTech. Par ailleurs, certains membres de cet axe thématique sont rattachés au service de Microbiologie clinique du GH Paris Saint-Joseph qui héberge la plateforme technologique de dosages. Clostridioides difficile est une bactérie anaérobie stricte, sporulée. C'est un entéropathogène majeur causant des diarrhées et des colites post-antibiotiques. Les infections à C. difficile (ICD) touchent particulièrement les patients hospitalisés dans les établissements de santé, lieux conjuguant de fortes densités de spores de C. difficile et une forte pression de sélection par les antibiotiques. Le spectre clinique des ICD est variable, allant de la colonisation asymptomatique à des formes sévères à l'origine de complications (1,2). En termes de physiopathologie, C. difficile s'implante classiquement dans un microbiote digestif préalablement perturbé par une antibiothérapie induisant une rupture de l'effet barrière (3,4). Cette étape de colonisation est un préalable indispensable à l'apparition des principaux signes cliniques de l'infection dus à la production des entérotoxines A et B possédant une action cytopathique et pro inflammatoire sur l'épithélium digestif. La réponse immune de l'hôte joue un rôle central dans l'évolution des ICD par la production d'anticorps neutralisant l'action de ces toxines (5,6). Les ICD sont également caractérisées par un important taux de récidives (~20%) qui ont un impact très important à la fois pour les établissements de soins (7,8) mais aussi sur la qualité de vie des patients (9). La persistance des C. difficile sous formes de spores au niveau digestif, une réponse immune suboptimale et la persistance de la dysbiose digestive apparaissent comme des facteurs importants et non exclusifs dans la survenue de ces récidives (3,5-6). Au final, l'ensemble des connaissances sur la physiopathologie des ICD a permis d'envisager de nouvelles stratégies de prévention et de traitement des ICD telle la préservation et la restauration du microbiote digestif et donc de son effet barrière (transplantation de microbiote fécal ou probiotiques de nouvelles génération) et la neutralisation de l'action des toxines que ce soit par immunisation passive avec des anticorps monoclonaux (bezlotozumab) ou après vaccination (candidats vaccin actuellement évalués en étude clinique de phase 3) (4,10). Cependant, il y a encore beaucoup de questions pour lesquelles nous n'avons pas de réponses à ce jour. Objectifs Le projet de thèse présenté vise à évaluer l'impact respectif de différents antibiotiques d'intérêt clinique (y compris ceux utilisés dans le traitement des ICD) sur le microbiote digestif - en caractérisant la dysbiose induite en corrélation avec les concentrations résiduelles d'antibiotique détectable dans les selles ; - en évaluant les conséquences de la dysbiose induite sur la dynamique de la colonisation digestive par C. difficile jusqu'à la clairance naturelle de la bactérie ; - en identifier les espèces/groupes d'espèces bactériennes du microbiote digestif favorisant/protégeant la colonisation et/ou l'infection par C. difficile et ceux favorisant la clairance/persistance de la colonisation par C. difficile ; - en évaluant l'impact sur l'hôte des différents degrés de dysbiose induite notamment i) sur la modification du profil des acides biliaires, et ii) sur la modulation de la réponse immune adaptative de l'hôte. Plan expérimental et matériel et méthodes Description des étapes du projet de thèse I- La première partie du projet de thèse portera sur l'utilisation du modèle expérimental d'infection/colonisation par C. difficile chez la souris, développé par l'équipe. Il s'agit de poursuivre les travaux initiés dans le cadre de cette mise au point en caractérisant les différents degrés de dysbiose provoquée par plusieurs schémas d'antibiothérapie corrélés aux dosages de concentrations résiduelles d'antibiotiques dans les selles. L'impact respectif de cette dysbiose sera évalué d'une part sur la dynamique de la colonisation digestive par C. difficile jusqu'à sa clairance naturelle et d'autre part sur l'hôte en termes de répercussions métaboliques avec la modification du profil des acides biliaires dont le rôle dans la germination des spores de C. difficile est particulièrement important (11) et sur la réponse immune de l'hôte chez un hôte naïf de tout antécédent d'infection. II- La deuxième partie du projet de thèse visera à identifier, par modélisation sur la base des données de culturomique et de métagénomique, les espèces ou groupes d'espèces bactériennes du microbiote digestif associés à i) l'effet barrière empêchant la colonisation digestive par C. difficile, ii) l'implantation de C. difficile dans le microbiote digestif voire à la survenue d'une infection, et iii) à clairance naturelle des spores et formes végétatives de C. difficile. Matériels et méthodes - Modèle expérimental d'infection/colonisation par C. difficile chez un hôte naïf de tout antécédent d'infection (modèle murin, C57/Bl6) (12) ; groupes conditionnels selon différentes classes d'antibiotiques d'intérêt clinique, y compris ceux classiquement utilisés dans le traitement des ICD (vancomycine, métronidazole, fidaxomycine) ; - Culturomique : étude quantitative (UFC/g selles) de la dynamique de colonisation digestive par C. difficile (spores et formes végétatives) jusqu'à la clairance de la bactérie (13,14) ; - Microbiote cultivable et non cultivable par métagénomique ciblée (basés sur l'amplification puis le séquençage de l'ADNr 16S ubiquitaire dans le monde bactérien) (14) ; - Technique de quantification pondérale par ELISA des immunoglobulines sériques (IgM et IgG) et mucosaux (IgA) spécifiquement dirigées contre plusieurs facteurs d'intérêt de la bactérie (toxines et composants de surface, brevet DI 2013-37, matériels et techniques déjà disponibles au laboratoire) et d'étude du pouvoir neutralisant des immunoglobulines par inhibition de l'effet cytopathogène des toxines sur cultures cellulaire ; - Méthodes de dosages de concentrations résiduelles d'antibiotiques dans les selles et détermination qualitative et quantitative du profil des acides biliaires par UHPLC-ESI-HRAM (Exactive plus, Orbitrap, plateforme de dosages du GH Paris Saint-Joseph). Lieu de réalisation du travail Le projet de thèse sera réalisé au sein de l'équipe Bactérie Pathogènes et Santé (BaPS), sous-équipe « antibiotiques, dysbiose et risque infectieux ». Les expérimentations animales se dérouleront dans l'animalerie axénique située dans les locaux de de l'équipe (BaPS) sur le campus de la faculté de Pharmacie de l'Université Paris-Saclay à Châtenay-Malabry (Plateforme Animex). Collaborations envisagées Toutes les collaborations qui s'avéreront nécessaires seront envisagées au cours de l'avancement de ce projet en fonction des premiers résultats obtenus. A ce jour, plusieurs collaborations sont d'ores et déjà entreprises ou en cours dans le cadre de ce projet avec : - l'équipe de la Plateforme technologique de dosages du GH Paris Saint-Joseph pour son expertise dans le dosage des antibiotiques résiduels coliques et son expertise sur les acides biliaires dans le cadre de l'activité sur les déficits congénitaux en acides biliaires ; - l'analyse du microbiote digestif par métagénomique quantitative en collaboration étroite avec plusieurs équipes de l'INRAe ayant cette expertise dont Métagenopolis (MGP), CPE et PhylHom (collaborations déjà en cours) ; - l'équipe INSERM U1181, Epidémiologie et modélisation de la résistance aux antimicrobiens, institut Pasteur, dirigée par le Pr D. Guillemot pour l'identification par modélisation des espèces/ groupes d'espèces bactériennes d'intérêt au sein du microbiote. Résultats attendus et perspectives Les premiers essais ont montré que nous pouvions reproduire une réponse immune contre les toxines A et B tout comme ce qui est observé chez l'Homme et d'en préciser la cinétique d'apparition (12). Des essais préliminaires ont montré que la réponse immune adaptative produite suite à une ICD était significativement plus importante parmi les animaux traités par des ATB que pour ceux qui n'avaient pas été traités (manuscrit en préparation). Ce travail permettra tout d'abord de confirmer et consolider ces résultats préliminaires et d'explorer les différentes hypothèses envisagées pour expliquer les déterminants à l'origine de ce résultat et notamment l'impact de la dysbiose induite par les antibiotiques co-administrés. Les échantillons biologiques collectés au cours de cet essai permettront de caractériser plus finement la réponse immune observée. La seconde partie de ce travail permettra d'identifier, par modélisation des données collectées in vivo, des espèces bactériennes d'intérêt favorisant la colonisation par C. difficile ou permettant au contraire de constituer un effet barrière du microbiote. En parallèle de ce projet, l'équipe travaillera sur les collections biologiques cliniquement documentées d'une cohorte prospective de patients infectés par C. difficile suivis à l'hôpital Saint-Joseph. La confrontation des données collectées parallèlement grâce au modèle expérimental d'infection/colonisation chez la souris et celles issues de patients infectés par C. difficile permettra d'identifier des espèces/ groupes d'espèces spécifiques chez l'Homme. Par la suite, l'étude des espèces bactériennes d'intérêt identifiées au cours de ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes intimes conduisant à la colonisation. Elle pourra inclure l'étude des interactions bactéries-bactéries et bactéries-cellules in vitro mais aussi in vivo par leur réintroduction dans le microbiote digestif des souris à flore conventionnelle ou plus dans un modèle expérimental d'infection/colonisation chez des souris gnotoxéniques à flore humanisée (collaboration équipes de l'INRAe).
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