GPRC5A signalling in human keratinocytes : development of a mimetic polypeptide and its application in skin wound healing. Signalisation GPRC5A dans le kératinocyte humain : développement d’un polypeptide mimétique et application à la cicatrisation cutanée

Archive ouverte

Chanteloube, Sarah

Edité par CCSD -

During the early stages of skin wound healing, the mechanical microenvironment of keratinocytes undergoes abrupt changes due to the loss of internal tension and stiffening of the underlying extracellular matrix, influencing the behavior of wound-edge cells. In this context, the GPRC5A receptor (G Protein-Coupled Receptor Class C Group 5 Member A) was identified as highly expressed in this region of the epidermis in a murine wound healing model. Subsequently, our laboratory demonstrated that GPRC5A expression responded to variations in rigidity in human keratinocytes, concomitant with the translocation of its C-terminal region from the perinuclear region to the nucleolus. Depletion of this receptor disrupted keratinocyte adhesion, migration, differentiation, and epidermal stratification. This led to the hypothesis that the receptor may play a crucial role in the early stages of wound re-epithelialization.The main goal of this thesis was to characterize the molecular mechanisms of receptor activation and the cleavage of its C-terminal domain in human keratinocytes. We initially produced a polypeptide mimicking the cytoplasmic C-terminal domain of GPRC5A. When used in GPRC5A-depleted keratinocytes (shGPRC5A), this polypeptide restored adhesion, migration, and epidermal stratification to levels close to native conditions. The polypeptide also allowed us to identify a preferential cleavage site (APY/STHF) in vitro, which was also found in wild-type human cells. Cathepsin G was identified as the enzyme primarily involved in this cleavage process. The study of truncated versions of the C-terminal domain identified a short peptide sequence essential for the cellular response.Information regarding the endogenous GPRC5A receptor also emerged, such as serine residue phosphorylation, although this post-translational modification does not appear to be directly linked to receptor activity. Additionally, we demonstrated that GPRC5A influences FAK/PI3K signaling pathways related to cell adhesion, migration, and survival, although the complete molecular mechanism remains to be elucidated.In conclusion, we have unveiled a novel molecular signaling pathway in keratinocytes involving the C-terminal region of GPRC5A. Furthermore, a mimetic polypeptide allows for partial restoration of GPRC5A activity in a depleted model and could serve as an interesting tool for improving the re-epithelialization process. . Lors des premières phases de la cicatrisation de la peau, le microenvironnement mécanique des kératinocytes change brutalement par la perte de la tension interne et la rigidification de la matrice extracellulaire sous-jacente, influençant ainsi le comportement des cellules des berges de la plaie. Dans ce contexte, le récepteur GPRC5A (récepteur couplé à une protéine G de classe C, groupe 5, membre A) a été identifié comme fortement exprimé dans cette région de l’épiderme dans un modèle de cicatrisation murin. Notre laboratoire a par la suite montré que l’expression de GPRC5A répondait aux variations de rigidité dans les kératinocytes humains, de façon concomitante à la translocation de sa région C-terminale de la région périnucléaire vers le nucléole. Enfin, la déplétion de ce récepteur aboutissait à la perturbation de l’adhérence et de la migration des kératinocytes, ainsi que de la différenciation et de la stratification épidermique. L’hypothèse que le récepteur pourrait jouer un rôle essentiel dans les étapes précoces de la ré-épithélialisation des plaies a donc été émise.Le but principal de cette thèse a été de caractériser les mécanismes moléculaires d’activation du récepteur et du clivage de son domaine C-terminal dans les kératinocytes humains.Nous avons d’abord produit un polypeptide imitant le domaine C-terminal cytoplasmique de GPRC5A. Ce polypeptide utilisé dans des kératinocytes déplétés en GPRC5A (shGPRC5A), a permis de recouvrer une adhérence, une migration et une stratification épidermique proches des conditions natives. Le polypeptide nous a également permis d’identifier un site de clivage préférentiel (APY/STHF) in vitro, qui a également pu être retrouvé dans les cellules humaines sauvages. La cathepsine G a été identifiée comme enzyme principalement impliquée dans ce processus de clivage. L'étude de versions tronquées du domaine C-terminal a permis d’identifier une courte séquence peptidique essentielle pour la réponse cellulaire. Des informations sur le récepteur GPRC5A endogène ont ensuite émergé, comme la phosphorylation des résidus sérines, bien que cette modification post-traductionnelle ne semble pas liée à l’activité du récepteur. Parallèlement, nous avons mis en évidence que GPRC5A jouait sur les voies de signalisation FAK/PI3K liées à l’adhérence, la migration et la survie des cellules, bien que le mécanisme moléculaire complet reste à élucider.Pour conclure, nous avons mis en évidence une nouvelle signalisation moléculaire dans les kératinocytes impliquant la région C-terminale de GPRC5A. De plus, un polypeptide mimétique permet une restauration partielle de l’activité de GPRC5A dans un modèle déplété, et pourrait ainsi constituer un outil intéressant pour améliorer l'étape de ré-épithélialisation.

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