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Role of the circadian rhythm in the transcription-coupled DNA double-strand break repair (TC-DSBR). Rôle du rythme circadien dans la réparation des cassures double-brin de l'ADN couplées à la transcription (TC-DSBR)
Archive ouverte
Edité par CCSD -
Every day, a cell maintains the stability of its genome by repairing spontaneous DNA damage, of which DNA Double-Strand Breaks (DSBs) are among the most toxic lesions. Due to secondary structures and topological constraints resulting from transcription, endogenous DSBs preferentially occur in active genes. It is therefore crucial that these lesions are properly addressed to the transcription-coupled DSB repair (TC-DSBR) pathway in order to maintain precise spatiotemporal gene expression and avoid cell death or the occurrence of mutations or chromosomal rearrangements, such as translocations. Thus, DSBs play a major role in many diseases, including cancer development and neurodegenerative diseases. Several steps have been identified in the TC-DSBR pathway such as transcriptional repression of the damaged gene, RNA:DNA hybrid resolution around DSB site and Homologous Recombination (HR)-mediated repair. However, only a few proteins involved in this pathway have been identified, and moreover, these DSBs in active genes (TC-DSBs) have also a strong ability to move within the nucleus via an unclear mechanism. The aim of my PhD thesis was to better characterize the TC-DSBR pathway by searching for new players and studying their role. For this purpose, we performed a multiple output screen on 130 candidate proteins and identified the PER complex, a core component of the circadian rhythm that is only expressed during the day. This rhythm, also known as the biological clock, regulates many biological processes (e.g. sleep/wake, hormone production, ...) with a 24-hour period (circa diem). To determine the role of the PER complex and the circadian Rhythm in the TC-DSBR pathway, I used RNA interference to deplete proteins of interest in the human DIvA cell line, which allows the induction of multiple annotated DSBs on the genome, mainly generated in transcriptionally active genes. Our work show that the PER complex is recruited to DSBs occurring in transcribed loci to promote proper repair by HR. Indeed, PER proteins are required for DSB end resection, RAD51 loading, translocation inhibition and cell survival. We further demonstrated that TC-DSBs are targeted to the nuclear envelope where the SUN1 protein is their anchoring point. We found that PER proteins contribute to this targeting of TC-DSBs to the envelope, which avoids their clustering and thus prevents chromosomal translocations. In agreement with these results, we show through circadian rhythm synchronization experiments in DIvA cells, that TC-DSB anchoring to the nuclear envelope and the assembly of RAD51 for HR repair follow the circadian oscillations of PER proteins. Finally, we showed that Etoposide treatment, a chemotherapy drug that induces DSBs in active genes, increases the DSB biomarker gammaH2AX when PER proteins are less expressed, suggesting less efficient repair during the night. Thus, the response to TC-DBSs induced by Etoposide exhibits the same circadian oscillation as that observed in the DIvA system. In conclusion, our study provides a direct link between the circadian rhythm and the repair of DSBs occurring in active genes, opening new chronopharmacological strategies for chemotherapies based on Etoposide-like topoisomerase poisons that mostly induce such DNA Damage. . Chaque jour, la cellule maintient la stabilité de son génome en réparant les dommages spontanés qui surviennent sur l'ADN, parmi lesquels les cassures double-brin (DSBs) sont parmi les lésions les plus toxiques. En raison des structures secondaires et des contraintes topologiques occasionnées par la transcription, les DSBs endogènes se produisent préférentiellement dans les gènes actifs. Il est donc crucial que ces lésions soient prises en charge par la voie de réparation des DSBs couplée à la transcription (TC-DSBR) afin de maintenir une expression génique spatio-temporelle précise et d'éviter la mort cellulaire ou l'apparition de mutations ou de réarrangements chromosomiques, tels que les translocations. Ainsi, les DSBs jouent un rôle prépondérant dans de nombreuses maladies, notamment le développement des cancers et les maladies neurodégénératives. Plusieurs étapes ont été identifiées dans la voie TC-DSBR, comme la répression transcriptionnelle du gène endommagé, la résolution des hybrides ARN:ADN autour de la cassure et la réparation médiée par la recombinaison homologue (HR). Cependant, seules quelques protéines impliquées dans cette voie ont été identifiées, et de plus, ces DSBs dans les gènes actifs (TC-DSBs) ont également une forte capacité à se déplacer dans le noyau via un mécanisme peu clair. L'objectif de ma thèse était de mieux caractériser la voie TC-DSBR en recherchant de nouveaux acteurs et en étudiant leur rôle. Dans ce but, nous avons réalisé un crible sur 130 protéines candidates et avons identifié le complexe PER, un composant central du rythme circadien qui est exprimé durant la journée. Ce rythme, aussi connu sous le nom d'horloge biologique, régule de nombreux processus biologiques (ex : sommeil/veille, production d'hormones, ...) avec une période 24 heures (circa diem). Pour déterminer le rôle du complexe PER et du rythme circadien dans la voie TC-DSBR, j'ai utilisé l'interférence ARN pour dépléter les protéines d'intérêt dans la lignée cellulaire humaine DIvA, qui permet l'induction de multiples DSBs annotées sur le génome, principalement générées dans les gènes transcriptionnellement actifs. Nos travaux montrent que le complexe PER est recruté aux DSBs se produisant dans les gènes actifs pour promouvoir une réparation correcte par HR. En effet, les protéines PER sont requises pour la résection des extrémités des DSBs, le chargement de la recombinase RAD51, l'inhibition des translocations et la survie cellulaire. Nous avons également mis en évidence que les TC-DSBs sont dirigés vers l'enveloppe nucléaire où la protéine SUN1 est leur point d'ancrage. Nous avons découvert que les protéines PER contribuent à cette relocalisation des TC-DSBs à l'enveloppe, ce qui évite leur regroupement et empêche ainsi la formation de translocations chromosomiques. En accord avec ces résultats, nous montrons par des expériences de synchronisation du rythme circadien dans les cellules DIvA, que l'ancrage des TC-DSBs à l'enveloppe nucléaire et l'assemblage de RAD51 pour la réparation par HR suivent les oscillations circadiennes des protéines PER. Enfin, nous avons observé qu'un traitement des cellules par l'Etoposide, un médicament de chimiothérapie qui induit des cassures dans les gènes actifs, augmente le marqueur des DSBs gammaH2AX pendant la phase où les protéines PER sont moins exprimées, suggérant une réparation moins efficace durant la nuit. Ainsi, la réponse aux TC-DBSs induits par l'étoposide présente la même oscillation circadienne que celle observée dans le système DIvA. En conclusion, notre étude fournit un lien direct entre le rythme circadien et la réparation spécifique des DSBs qui se produisent dans les gènes actifs, ouvrant de nouvelles stratégies chronopharmacologiques pour les chimiothérapies basées sur les poisons de la topoisomérase, de type Etoposide, qui induisent principalement ce type de dommages à l'ADN.
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