Syracuse

Optimisation of heterologous secreted protein production by the model lactic acid bacteria Lactococcus lactis. Optimisation de la production de protéines hétérologues sécrétées chez la bactérie alimentaire Lactococcus lactis

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Morello, Eric, E.

Edité par CCSD -

Faculté des Sciences d'Orsay Mémoire de thèse N° d'ordre 8479. This study aimed to develop the use of Lactococcus lactis, the model lactic acid bacteria, as host for the production of heterologous secreted proteins at the industrial scale. This host has been optimised identifying and characterising factors influencing various stages of the protein secretion process efficiency. On early secretion stage, the ybdD gene of unknown fonction has been identified by random insertional mutagenesis. This gene encode a limiting factor affecting the transcription step of our reporter gene. On intermediary secretion stage, the expression of the Bacillus subtilis SecDF protein in L. lactis increases the production and secretion of some proteins by probably improving the global production and/or secretion processes. This effect could result from translocated precursor stabilization or translocation process enhancement. Finally, these identified secretion enhancer host factors have been combined to a newly developped expression-secretion system: the zinc promoter (identified and pattented by the laboratory), and efficient secretion signals (signal-peptides and synthetic propeptides). This work allowed to make an optimized and integrated expression/secretion system of heterologous proteins in L. lactis reaching competitive production level in this bacterium. . Cette thèse a eu pour but de développer l’utilisation de Lactococcus lactis, bactérie lactique alimentaire modèle, comme hôte de production de protéines recombinantes sous forme sécrétée à l’échelle industrielle pour la commercialisation de protéines. L’hôte de production L. Lactis a été optimisé en identifiant et en caractérisant des facteurs influençant l’efficacité du processus global de sécrétion de protéines au niveau de différentes phases. Concernant les phases précoces, le gène ybdD de fonction inconnue chez L. Lactis a été identifié par mutagenèse insertionnelle aléatoire. Il code un facteur limitant dans l'étape de transcription du gène codant le rapporteur sécrété utilisé. Concernant les phases intermédiaires de la sécrétion, l’introduction chez L. Lactis de la protéine SecDF de Bacillus subtilis permet d’augmenter la quantité de protéines produites et sécrétées suggérant une amélioration globale de la production et/ou de la sécrétion via une stabilisation du précurseur en cours de translocation ou une accélération de ce processus. Au cours d’une partie appliquée, les éléments identifiés au cours de la phase d’optimisation de l’hôte de production ont été combinés à un nouveaux système d’expression : le promoteur zinc (identifié et breveté au laboratoire), et des signaux de sécrétion efficaces (peptides signaux et propeptide synthétique). Ces travaux ont permis de constituer chez L. Lactis, un système intégré d’expression-sécrétion optimisé, atteignant des niveaux élevés de production, de sécrétion et de pureté de protéines hétérologues chez cette bactérie.

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