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La résistance aux traitements des gliomes diffus du tronc cérébral : Rôle de la mutation H3.3 K27M ?
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Edité par CCSD -
International audience. De nos jours, on estime qu’un enfant sur 440 sera atteint d’un cancer avant l’âge de 15 ans et l’incidence des tumeurs cérébrales pédiatriques est en constante hausse (INCa, 2015). Malgré un taux de survie à 5 ans de 75% pour l’ensemble des tumeurs cérébrales pédiatriques, les gliomes diffus du tronc cérébral (ou DIPG) sont particulièrement résistants aux traitements et restent de très mauvais pronostic, avec un taux de survie à 5 ans de moins de 1%. La caractéristique principale des DIPG est une mutation mono-allélique de l’histone H3, qui consiste en la substitution du résidu lysine 27 par une méthionine (H3K27M) et qui perturbe le paysage épigénétique des cellules de DIPG dans sa globalité. Cette mutation s’observe majoritairement sur le variant H3.3 (H3.3K27M) et corrèle, dans ce cas, avec le pronostic le plus péjoratif. Néanmoins, le rôle potentiel de la mutation H3.3K27M dans la résistance aux traitements et le caractère agressif de ces tumeurs demeure indéfini. Afin d’étudier finement le rôle de la mutation H3.3K27M dans la biologie des cellules de DIPG, nous avons développé une stratégie de gene editing, basée sur l’utilisation combinée de la technologie CRISPR/Cas9 et d’un insert. L’application de cette stratégie à quatre lignées cellulaires de DIPG, initialement mutées H3.3K27M, vise à établir des modèles cellulaires originaux de réversion de la mutation. En comparant ces modèles de réversion aux cellules parentales mutées, nous souhaitons définir précisément le rôle de la mutation dans divers effets biologiques associés au caractère agressif. Nous évaluerons notamment leur capacité d’invasion, par des tests en 3 dimensions, puisque l’aspect infiltrant des DIPG constitue un frein majeur à leur exérèse chirurgicale. D’autre part, étant donné les liens entre métabolisme cellulaire et résistance aux traitements, nous mesurerons les changements métaboliques causés par la réversion de la mutation en analysant le profil métabolique de gliosphères, issues de nos modèles et des lignées parentales, à l’aide de la technologie XF seahorse (Agilent). Concernant la résistance aux traitements, la détermination de fractions de survie par des tests de clonogénicité après irradiation de nos modèles cellulaires à des doses croissantes nous permettront d’évaluer l’impact de la mutation sur la réponse à la radiothérapie. Aussi, le screening d’une banque de drogues, élaborée à façon, et la détermination d’IC50 sur nos modèles nous permettront de déterminer quelles familles d’agents anticancéreux voient leur efficacité impactée par la mutation et d’identifier des acteurs moléculaires et voies de signalisation associées à la mutation. Enfin, des études de RNA-seq (transcriptomique) et de CUT&RUN (épigénomique), dont l’analyse sera guidée par les effets biologiques observés, nous permettront de mieux appréhender les déterminants moléculaires responsables de ces effets biologiques associés à la mutation. Par l’application de notre stratégie de gene editing, j’ai récemment obtenu des modèles inédits de réversion de la mutation H3.3K27M dans les lignées cellulaires HSJD-DIPG-12 et HSJD-DIPG-013. Fort de l’établissement de ces modèles, des tests visant à comparer l’invasion en matrigel et la réponse à la radiothérapie de ces modèles et des lignées correspondantes sont en cours. Nous avons également développé un workflow qui nous permettra d’analyser le métabolisme cellulaire sur gliosphères et d’appréhender ainsi la question de l’impact de la mutation sur le métabolisme énergétique. Enfin, les résultats que nous obtiendrons lors du screening de drogues, de l’évaluation du rôle de la mutation sur la réponse à la radiothérapie et des études « omiques » feront l’objet d’un recoupement avec des résultats préalablement obtenus sur des modèles cellulaires induits pour la mutation. Pour résumer, la caractérisation comparative de nos modèles cellulaires de réversion de la mutation H3.3K27M, obtenus dans les lignées HSJD-DIPG-012 et -013, nous permettra de déterminer si, outre son rôle dans la tumorigenèse, cette mutation participe au caractère agressif et résistant de ces tumeurs et, ainsi, de savoir si les mécanismes y étant associés présentent un potentiel intérêt thérapeutique.
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