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Un système d'expression par intégration ciblée chez Yarrowia lipolytica : application à l'étude de protéines hétérologues par mutagénèse dirigée
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Edité par CCSD -
Nous avons développé un système d'expression/sécrétion de protéines hétérologues chez la levure Yarrowia lipolytica utilisant un promoteur recombinant. En particulier, une série de vecteurs intégratifs monocopie, basés sur pBR322, est particulièrement adaptée à l'étude de protéines hétérologues par mutagénèse dirigée. La linéarisation de ces vecteurs navettes dans la région "pBR" permet de diriger efficacement leur intégration par homologie dans une "plateforme pBR" intégrée dans le génome de la souche réceptrice de Y. lipolytica. Ainsi, les transformants obtenus contiennent une seule copie du gène hétérologue, intégrée en un unique site bien défini, sans risque d'interaction avec les fonctions cellulaires. L'utilisation de séquences signal de sécrétion permet d'obtenir la sécrétion de la protéine recombinante dans le milieu de culture. Ce système d'expression/sécrétion par intégration ciblée permet donc d'analyser facilement l'effet de mutations dans le gène hétérologue, en comparant les propriétés des protéines recombinantes sécrétées par les transformants. La fréquence de transformation très élevée obtenue dans ce système permettrait également de l'utiliser pour des expériences de mutagénèse au hasard par PCR, ou d'évolution moléculaire.Nous décrirons deux exemples d'utilisation de ce système pour la mutagénèse dirigée : celui d'une laccase fongique, de Trametes versicolor, et celui d'une enzyme de plante, la cytokinine oxydase (CKO1) de Zea mays. Pour la laccase de T. versicolor, nous avons pu obtenir, par mutagénèse dirigée, un déplacement vers la neutralité du pH optimal vis-à-vis d'un substrat phénolique, ce qui constitue une étape dans l'optimisation de l'enzyme pour des applications environnementales. Pour la CKO1 de Z. mays, l'enzyme recombinante produite chez Y. lipolytica a été cristallisée, ce qui nous permet de déterminer la structure des complexes formés par l'enzyme avec différents inhibiteurs et accepteurs d'électrons. Les données obtenues ont permis de cibler des acides aminés pour une mutagénèse dirigée, afin d'analyser les mécanismes réactionnels.
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